疫苗的早期遞送系統

魚精蛋白是一種富含精氨酸的陽離子蛋白的混合物，與mRNA形成絡合物。與裸露的mRNA相比，該絡合物提高了轉染效率。之后因為魚精蛋白絡合mRNA部分抑制蛋白質表達，引入了游離mRNA和魚精蛋白絡合mRNA的混合物。動態光散射實驗表明，游離的mRNA的大小接近50nm，而魚精蛋白/mRNA絡合物的大小在250-350nm。

CureVac公司對狂犬病疫苗候選物CV7201就采用了這種方法，CV7201是一種凍干的、溫度穩定的裸露的mRNA，由編碼狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的游離和魚精蛋白絡合mRNA組成。在Balb/c小鼠中，兩次給予10 µg及以上的誘導的中和效價大于世界衛生組織的保護閾值，并且兩次給予80 µg的劑量對大腦有保護作用。在一項通過皮下和肌內途徑的注射80–640 µg劑量的1期人體試驗中，*一個小組使用特定的注射裝置接受了三次80–400 µg劑量，達到了世衛組織中和效價閾值。

其中101名參與者中有一名在高劑量下產生了嚴重的不良反應(貝爾麻痹)，同時有5%的參與者也產生嚴重不良反應。不良反應的總體發生率很高，其中有97%在注射部位產生不良反應，有78%產生全身不良反應。由于魚精蛋白絡合mRNA的給藥效果并不理想，CureVac公司采用了來自Acuitas的納米顆粒脂質體遞送系統，并證明在Balb/c小鼠中以0.5 µg的低劑量 (與魚精蛋白絡合mRNA的10 µg相比)和非人的靈長類動物中以10 µg的劑量給藥極大提高了中和效價。T細胞反應的**以及引流淋巴結和注射部位中的白細胞介素-6（IL-6）和**壞死因子（TNF）表明了LNP在介導陽性免疫反應中的作用。目前已經啟動了一項臨床試驗(NCT03713086)，預計2021年將報道中期結果。

通過將陽離子脂質DOTAP與含有角鯊烯、山梨醇三油酸酯和聚山梨酯80的商業佐劑(MF59)在pH 6.5的檸檬酸鹽緩沖液中混合，開發了用于mRNA遞送的陽離子納米乳劑(CNE)。將編碼呼吸道合胞病毒糖蛋白(RSV-f)的自擴增mRNA和來自DOTAP的NP胺聯合應用，后者與mRNA中磷酸鹽的比例為7，生成了大小為129 nm的納米顆粒。

采用這種方法的一個優點是能夠分別存儲CNE和mRNA，并且*在使用時將它們結合起來。在Balb/c小鼠中兩次給藥15 µg的中和效價高于亞單位佐劑疫苗的效價。在非人類靈長類動物中兩次給藥75 µg就可以達到可檢測到的中和效價和T細胞反應。基于這一概念，一個**的團隊創造了納米結構脂質載體(NLC)，它是CNE和脂質納米顆粒的混合物，由液態油相(如角鯊烯)和飽和甘油三酯的固相脂質組成。NLCs含有編碼sika梅花鹿免疫原的自擴增mRNA，其大小為40 nm，NP比為15，并且在單次注射低至0.1 µg或0.01 µg的劑量后能夠在C57BL/6小鼠中產生保護性中和效價。

用于mRNA遞送的聚合物

幾十年來，陽離子聚合物已廣用于核酸遞送，例如包括聚賴氨酸、聚乙烯亞胺（PEI）、DEAE-葡聚糖、聚β氨基酯(PBAE)和殼聚糖。*簡單方式即把過量陽離子聚合物與核酸混合，形成靜電結合的陽離子多聚體。

盡管已經開發了許多聚合物，但它們不如用于核酸遞送的脂質納米粒先進，并且能將它們成功應用于的動物研究的疫苗有限。PBAE與PEG脂質混合，形成mRNA/PBAE/PEG納米顆粒脂質體，能夠在小鼠靜脈注射后將mRNA遞送至肺部。在靜脈注射基因遞送**后使用*******作為考察報告，一種可生物降解的聚合物，聚胺共酯(PACE)三元共聚物在mRNA遞送中已經被驗證。通過控制分子量和端基化學，PACE家族的一個10 kDa的結構實現了與TransIT相同的體外轉染效率，TransIT是一種有效但有毒的、膠體不穩定的且大體積商業產品。*******在靜脈注射20 µg時的體內表達效果是TransIT的5倍。

合成了超支化聚β-氨基酯（hPBAE）用于通過吸入將mRNA遞送至肺。hPBAE mRNA復合物的大小為137 nm，在小鼠中霧化時能夠轉染25%的肺內皮細胞，吸入沒有明顯的毒性，表達水平是分支化PEI的10倍。合成了分子量在8 kDa至167 kDa之間的二硫化物連接的聚酰胺基胺（pABOL），它能夠形成大小接近100 nm的多分散納米復合物。

這些使用自擴增mRNA復合物的體內熒光霉素的表達結果與肌肉注射PEI相似。當對小鼠以增強免疫策略進行血凝素(HA)流感免疫原給藥時，低分子量8 kDa的pABOL中和效價高，超過PEI。8 kDa的pABOL能釋放1μg HA的自擴增mRNA，也能部分抵御致命的流感，防止死亡，但不能防止體重**下降。倫敦帝國理工學院的研究組認為，這種pABOL系統可以為SARS-CoV-2提供一種自擴增的mRNA免疫原，但使用pABOL給藥SARS-CoV-2免疫原的效果比使用Acuitas優化的納米顆粒脂質體給藥的效果低1000倍。

總的來說，1μg pABOL中自擴增RNA產生的結合抗體和中和效價與0.001μg優化的脂質納米顆粒相同(Dr. Anna Blakney)。許多其他聚合物系統能夠在體外或體內遞送mRNA，但仍需對疫苗進行測試。

研究進展

當前中SARS-CoV-2納米顆粒脂質體的研究進展

*早的mRNA轉染試劑是季銨化陽離子DOTAP結合可電離和促細胞融合的DOPE，從DNA轉染得到，用于多種細胞類型中的mRNA轉染。雖然在體外有效，但**性的陽離子季銨基團使這些大體積的脂質體迅速從體循環和靶向**肺中被**，并表現出毒性。

目前的LNP的前體是穩定的質粒-脂質顆粒(SPLP)，它是通過結合促細胞融合的可電離的DOPE和季銨化的陽離子脂質DODAC而形成的，通過靜電作用包裹質粒DNA，然后再用親水的PEG包被脂質體，使其在水溶液中穩定，并在體內給藥時限制蛋白質和細胞的相互作用。

遞送機制*關鍵的一步是：細胞內吞后，DOPE在內涵體內被質子化，并且由于DOPE的錐形結構，可以與內涵體磷脂形成一個內涵體溶解離子對，以促進內涵體釋放。SPLP后來進一步發展為含有siRNA的穩定化核酸脂質顆粒(SNALP)，包括四種脂質:可離子化而非季銨化的陽離子脂質、形成季銨化兩性離子的飽和雙層脂質、DSPC、膽固醇和PEG-脂質。除了與核酸靜電結合之外，SNALPs中的可電離脂質起到融合脂質的作用，并在內涵體中質子化，與內涵體磷脂形成膜不穩定離子對。目前已知DSPC有助于在PEG表面下形成穩定的雙分子層。膽固醇起著多種作用，包括填充顆粒間隙、限制LNP-蛋白質相互作用以及可能促進膜融合。可電離的脂質的**作用是在生理酸堿度下保持中性，從而消除循環中的陽離子電荷，但在pH為6.5時在內涵體中被質子化，促進內涵體逃逸。

2018年獲得臨床批準的**siRNA產品的開發主要集中在優化可電離脂質，其次是PEG-脂質和LNP中四種脂質的比例，以及LNP組裝和制備過程。根據分子形狀假說，發現C18尾中不飽和鍵的**數目是提供一個通過醚類與二甲胺頭部相連的二油酸尾部。

然而，將單一的連接體引入二油酸尾部，從二甲胺頭部到連接體的碳數經過優化，導致LNP可電離脂質的pKa值接近可電離脂質DLin-MC3-DMA的6.4。優化的佳一步是將MC3/DSPC/膽固醇/PEG-脂質的這些脂質的摩爾比調整為50/10/38.5/1.5。

總體來說，從DLin-DMA到DLin-MC3-DMA的這一優化過程需要在數千種**中篩選300多種可電離脂質，并導致效果增加200倍以及有效劑量相應減少，以實現對> 80%的靶基因和**窗的長久抑制，OnpattroTM在2018年獲得臨床批準。為siRNA開發的這種MC3制劑是下文所述的LNP后續開發的基礎(圖1)。這些LNP在被批準用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗后，正處于緊急使用。

圖1：mRNA納米顆粒脂質體結構。使用冷凍電子顯微鏡、小角中子散射和小角x光散射表明，mRNA脂質納米顆粒包括低拷貝數的mRNA(1–10)，并且mRNA在LNP中心與可電離脂質結合。PEG脂質與DSPC一起形成LNP的雙層表面。膽固醇和可電離的脂質以帶電和不帶電的形式分布在整個LNP。可在*近的綜述中獲得其他遞送系統的結構示意圖。

為了遞送核苷修飾的mRNA編碼的免疫原，Moderna使用上述Onpattro制劑中的MC3進行了幾項臨床前和臨床研究。通過在這些研究中將一類新的可電離脂質與MC3進行了比較，證實了MC3是可電離脂質。這一新種類包括脂質H，它是Moderna公司的SARS-CoV-2產品mRNA-1273(表2)中可電離的脂質SM-102。

使用核苷修飾的mRNA編碼寨卡病毒免疫原，MC3 LNP能夠保護缺乏ⅰ型和ⅱ型干擾素(IFN)信號的免疫低下小鼠，在免疫增強策略中使用一次10 µg劑量或兩次2 µg劑量將抑制小鼠的死亡。在免疫功能正常的小鼠中，預先用抗ifnar1阻斷抗體遞送來建立一個致死模型，也得到了相似的結果。在一系列核苷修飾mRNA編碼血凝素(HA)免疫原遞送的流感研究中，皮下給藥的MC3 LNP能夠以低至0.4 µg的單劑量充分保護小鼠免受死亡，即使使用單劑量高達10 µg體重也還是減輕。

單劑量50 µg或100 µg在雪貂中產生高HAI(血凝抑制試驗)效價，在非人的靈長類動物中兩次給藥200或400 µg也是如此。在被給藥100 µg的一小部分(23名)受試者中，所有受試者的HAI效價> 40(世衛組織相關的保護指標)，比研究開始時的基線高出4倍以上。在一個更大的I期試驗中，使用相同的MC3 LNPs遞送兩種不同的核苷修飾的mRNA編碼的HA免疫原，肌肉注射100µg H10N8免疫原導致所有23名受試者的HAI效價> 40。

盡管沒有發生危及生命的不良反應，但這23名受試者中有3人產生了嚴重的3級不良反應。在三名受試者中有兩名出現可以暫停試驗的3級不良反應后，停止了預計的400 µg給藥量。在較低劑量下，盡管幾乎每個受試者都產生至少一次不良反應，但不良反應的頻率和嚴重程度降低。這些研究是有前途的，也強調了相對狹窄的**窗，以不引起不良反應的劑量下獲得保護性免疫。這讓人想起MC3前體DLin-DMA狹窄的**窗，需要提高效價以降低劑量，但仍然能實現有效的基因敲除。

表2：納米顆粒脂質體中使用的可電離脂質。納米顆粒脂質體中使用的可電離脂質的一個關鍵特征是，通過TNS染料結合試驗測量的LNP可電離脂質的pKa值應在6–7的范圍內。大多數可電離基團的理論計算pKa值在8-9.5的范圍內，如下所示的氮原子在水介質中，使用商業軟件從理論上估計這些值。pKa值從理論值到TNS值下降了2-3個點，這是由于脂質相中質子溶劑化的能量高得多，導致在TNS分析過程中測量的脂質中的pH比水相的pH增加了2-3個點。

由于siRNA產品需要對慢性疾病重復給藥，因此人們擔心MC3中二醇烷基尾的緩慢降解會導致重復給藥的累積和潛在毒性。MC3的生物可降解變體，脂質319(表2)，是通過用一種在體內容易被酯酶降解的伯酯取代烷基鏈中的兩個雙鍵之一而產生的。脂質319在肝臟中的半衰期不到一小時，但它在肝臟中保持的基因沉默效率與MC3相似。

在體內的降解產物及其分泌和脂質319的無毒性質得到了證實。在SARS-CoV-2的臨床前和臨床研究中采用脂質319的這一研究為代，在BioNTech和CureVac產品中使用Acuitas LNP，盡管在倫敦帝國理工學院試驗中自擴增RNA的Acuitas LNP給藥被用于*近的zhuan利申請中，以來自Acuitas的脂質A9代(參考表2)。*近，BioNTech批準的BNT162b2中的Acuitas可電離脂質是ALC-0315(表2)。這些LNP的一個重要特點是，它們是通過在靜脈注射后篩選肝臟中的mRNA表達而開發的，可能還沒有*優化用于肌內注射mRNA的疫苗。

Moderna*近開發了一類新的可電離脂質來替代MC3，主要是由于上MC3緩慢降解，通過使其具有比二醇MC3烷基尾更大的分支來提高其效價。這種新型脂質有一個乙醇胺可電離的頭部，連接到一個含有一級可降解酯的飽和尾部(如Maier 2013)和第二個飽和尾部，第二個飽和尾部在七個碳后使用一個不太可降解的二級酯分支成兩個飽和C8尾部，如脂質5 (表2)，其針對靜脈注射到肝臟進行了優化，還發現一個類似的脂質H或SM-102，*適合進行肌肉注射疫苗。

Acuitas研發脂質的的一個特征是增加分支，脂質A9總共有五條支鏈 (表2)，而Moderna LNP中SM-102有三條分支。增加的分支產生了一種具有更類似圓錐形結構的可電離脂質，因此，當陽離子脂質與內涵體中的陰離子磷脂配對時，將出現更大的膜破壞能力，符合幾十年前的分子形狀假說。

當靜脈注射時，24小時內肝臟中未檢測到脂質5，而MC3在肝臟中的初始劑量為71%，這驗證了脂質5的降解性。靜脈注射后，脂質5在小鼠體內的熒光素酶表達比MC3強3倍，在非人的靈長類動物體內的hEPO表達比MC3強5倍。效價的這些增加與內涵體釋放的增加一致，并且推測可能是由內涵體釋放的增加引起的，對于脂質5，細胞中多達15%的mRNA從內涵體中釋放，而對于MC3，這一比例為2.5%，后者與之前使用siRNA測量的MC3相似。

然而，在這些內涵體釋放實驗中，MC3的細胞攝取率比脂質5的高四倍，因此這兩種LNP在細胞質中釋放的mRNA的**量是相似的。在肌肉注射疫苗時進行了同樣的可電離脂質庫研究，同樣發現其可降解，并由于一級酯而迅速消除，并且與MC3相比，在蛋白質表達或免疫原性方面，小鼠中流感核苷修飾的mRNA編碼免疫原的效果增加了3-6倍，盡管在非人的靈長類動物中的免疫原性與5 µg增強免疫劑量的MC3相同。

脂質H或SM-102(表2)被確定為**候選物，并且在結構上*與脂質5不同。脂質5通過伯酯的兩個碳置換，是靜脈給藥的**藥物。脂質5 LNP的pKa值為6.56，而脂質H LNP的值為6.68，這表明pKa值的輕微增加可能有利于肌肉注射和靜脈注射給藥，盡管這種差異在檢測的可變性范圍內。對大鼠肌肉注射部位的組織學檢查表明，與MC3相比，脂質H LNPs吸引的富含中性粒細胞和巨噬細胞的炎癥浸潤較少，這可能會降低人體試驗中注射部位的反應原性。